靈芝是一種珍貴的藥用真菌，幾千年來在國內外作為“仙草”被廣泛應用於臨床治療和保健。近些年來，許多國家和地區對靈芝開展了較系統深入研究，特別是對其培養基組成，培養方法及菌絲體工業深層發酵及其有效成分靈芝多糖的研究更為深入[1]，在此基礎上也有較多的靈芝新療效、新用途的報導[2,3]。而對靈芝的遺傳育種研究甚少，為獲得優質高產的靈芝菌株，我們對靈芝種內原生質體融合進行研究，而菌株的標記是關鍵之一。
1. 材料，靈芝、菌株H、靈芝K、放線菌酮、多菌靈、速克靈、三唑酮、**麩培養基
將H，K分別接種於**麩平板培養基上，在24°C下培養10天，用直徑7mm的打孔器沿菌絲生長尖端打孔，然後將菌絲塊分別接至含不同藥物濃度的放線菌酮、多菌靈、速克靈、三唑酮和不含藥的**麩培養基上，每處重複4皿，24°C培養10天，然後測菌落直徑，如表一所示：
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藥物名稱
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藥物濃度（mg/mL）
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H(cm)
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K(cm)
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放線菌酮
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對照
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10.0
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10.0
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2.8
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2.3
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1.3
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3.0
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0.8
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0.8
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3.2
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1.1
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0.8
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3.4
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0.0
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0.0
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3.6
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0.0
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0.0
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多菌靈
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對照
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10
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10
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50
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1.6
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2.0
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90
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1.3
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1.4
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400
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0.0
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0.0
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800
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0.0
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0.0
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1000
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0.0
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0.0
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三唑酮
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對照
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10.0
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10.0
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70
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2.3
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2.8
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80
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2.1
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2.4
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90
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2.0
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2.2
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100
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1.9
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2.2
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110
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1.5
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1.6
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速克靈
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對照
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10.0
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10.0
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200
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4.4
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4.6
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400
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4.3
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3.5
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600
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3.8
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3.1
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800
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3.1
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2.4
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1000
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3.0
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2.2
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從表中我們可以看到，H、K菌株在放線菌酮劑量達3.4μg/mL，多菌靈劑量達400μg/mL時接種塊全部死亡，而其餘兩種藥物對供試菌株的抑制不明顯，因此，可用放線菌酮，多菌靈分別作為H，K菌株的標記藥物。
按肖在勤的方法[4]進行標記，分別用15μg/mL放線菌酮和1.1mg/mL多菌靈的**麩培養基製成藥物梯度平板，分別接種H、K，24°C下培養，待長出新菌絲後，去除接種塊，將平皿經紫外線處理（波長為257nm，距離為15cm）分別處理0（對照），2，4，6，8min，每處理重複8皿。避光培養20小時，在高濃度藥物的一側挑取H、K菌絲分別移至含有15μg/mL 放線菌酮和含有1.1mg/mL多菌靈的20mL**麩培養基上，24°C培養，轉代3~4次後的穩定菌株為具有抗藥性標記菌株。H、K菌株經紫外線處理後，在藥物濃度梯度平板上培養一定時間，取出發現，照射4~6min的處理中菌落菌絲生長較快，將生長快的尖端菌絲分別挑取280個菌塊，224葛菌塊轉接到含15μg/mL放線菌酮和1.1.mg/mL多菌靈培養基上，分別得到123葛，110葛抗藥突變體，且在含藥培養基上連續轉接培養3次，仍保持其抗藥性。H菌株經誘變後，所得到突變根據菌落形態及生長速度分為三種類型 mH1、mH2、mH3，選擇生長速度最快的mH1作為融合標記菌株。K菌株經誘變後，所得突變體可分為二種類型mK1,mK2,，選擇生長速度塊的mK1作為融合標記菌株。
參考文獻
1 趙繼鼎，等。真菌學報，1992，11（1）：55
2 韓玉複，等。中藥材，1995，18（5）：266
3 陳國良，等。中國食用菌，1995，14（4）：7
4 肖在勤。食用菌，1989，11（4）：36
* 曹文芩 女，1988年畢業於中國農業大學微生物專業，1996年中國協和醫科大學研究生畢業。現為中國醫學科學院、中國協和醫科大學藥用植物研究所副研究員，主要從事藥用真菌、藥用植物與真菌關係的研究，發表論文13篇。
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