摘要

目的：研究靈芝三萜對肝纖維化的保護作用機制，並探討其作用機制。

方法：將44只動物隨機分為6組，正常組、模型組、苦參素對照組、靈芝三萜小、中、大劑量組。動物皮下注射四氯化碳（CCL4）油溶液造模連續10周。于造模後第4周開始以小、中、大劑量靈芝三萜進行灌胃，劑量分別是45，90，180 mg.kg-1灌胃。至第10週末處死全部動物，收集血清檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、穀氨醯轉移酶（GGT）；肝組織進行HE染色，RT-PCR檢測轉化生長因數β1mRNA(TGF—β1mRNA)的表達，Western-Blot檢測基質金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達。

結果：與模型組相比靈芝三萜治療組能夠顯著減輕大鼠肝纖維化的程度。

結論：靈芝三萜對CCl4所致的動物肝纖維化有明顯地保護作用，其機制可能是通過抑制TGF-β1mRNA的表達和降低MMP-2的表達來減少膠原纖維地合成。

肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理基礎，是肝硬化的必經階段，其實質是細胞外基質（extracel-lular matix,ECM）的合成與降解失衡，導致ECM在肝內過量沉積[1]。隨著對肝纖維化發生機制認識的不斷深化，現在證實肝纖維化是可逆性病變[2]，因此，如何防治肝纖維化是目前備受關注的問題[3]。我國傳統中藥靈芝中的三萜成分能有效地保護動物急性肝損傷，降低血清天冬氨酸轉氨酶（AST）以及肝臟的甘油三酯（TG）水準[4]，還有抑制膽固醇的生物合成、抗脂質過氧化等作用。然而對肝纖維化是否有保護作用，目前尚未見有此方面的報導，本實驗運用經典的四氯化碳模型，觀察血清學指標，肝臟病理切片來瞭解其是否有抗纖維化作用。並初步探討其抗纖維化的機制。

材料：選擇44只小動物雌雄各半；靈芝三貼（含量為92.5%）；四氯化碳；抗兔IgG；Super Singal化學發光試劑盒；聚合酶鏈反應試劑盒。

方法：分組造模  將44只小動物隨即分為6組，正常組6只；肝纖維化模型組8只；陽性對照藥苦參素治療組6只；靈芝三萜小、中、大劑量治療組每組各8只。各造模組動物首次皮下注射40%的四氯化碳油溶液0.5mL.(100g)-1，以後每週2次皮下注射40%四氯化碳0.3 mL.(100g)-1，連續10周，建造模型。 建模後第四周開始以小、中、大劑量靈芝三萜進行灌胃（劑量分別是以45，90，180 mg.kg-1），苦參素100mg.kg-1灌胃。正常組和模型組同時以0.5mL.(100g)-1灌以生理鹽水。所有動物用普通飼料餵養。每週稱重一次，並調整給藥劑量。

處理：至第10週末，對小動物進行解剖，取部分肝組織進行固定處理。進行1：HE染色體觀察。2：血清學指標觀察，測定丙氨酸轉氨酶（ALT），AST，穀氨醯轉移酶（GGT）。3：RT-PCR檢測肝臟組織中TGF-β1的表達。4：統計學處理，使用stata 7.0進行相關資料處理，資料以x均值±s表示。運用單因素方差分析和相關分析。

結果：血清學檢測- 模型組動物血清AST、ALT、GGT比正常組明顯升高（P<0.01）。靈芝三萜各治療組AST、ALT、GGT明顯低於模型組（P<0.05），其中三萜中大劑量組的ALT、GGT與模型組相比差異有極顯著性（P<0.01），且各劑量組織之間存在量效關係。見表1.

表1 靈芝三萜對大鼠血清ALT、AST及GGT的影響（x的均值±s）

注：與模型組相比，aP<0.05，bP<0.01；與正常組相比，cP<0.01。

肝組織病理切片：光鏡觀察可見模型組：正常肝小葉結構嚴重紊亂，胞漿內可見嚴重的脂肪變性，纖維組織顯著增生，纖維間隔大量形成；靈芝三萜，大、中、小劑量的各組，均有所改善，藥物劑量的越大，改善狀況越明顯。而其中大劑量靈芝三萜組：輕度脂肪變性且僅有少量纖維組織，小葉結構明顯改善，肝小葉呈放射狀分佈，匯管區結締組合字增生不明顯。

肝組織內TGF-β1 mRNA的表達，與正常組相比模型組TGF-β1 mRNA的表達明顯增多；較模型組相比，靈芝三萜各治療組均能下調TGF-β1 mRNA的表達（P<0.05），且各劑量組織之間存在量效關係。苦參素組較模型組也顯著下降（P<0.01）.

肝組織中MMP-2的表達，模型組MMP-2的表達較正常組明顯增加（P<0.01），而靈芝三萜中、高劑量治療組MMP-2的表達與模型組相比有所降低（P<0.05），且隨著靈芝三萜劑量的增加，MMP-2的表達有所降低。

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05

結論： 本實驗運用經典的四氯化碳模型，同時以小、中、大劑量靈芝三萜給予治療，通過檢測血清學指標，結果發現靈芝三萜能夠有效降低上述指標，表明了其對受損肝臟有保護作用；此外從組織病理切片發現治療組的肝纖維化病變明顯改善，並且呈現劑量相關性。 

TGF-β1被認為是最重要的致肝纖維化因數，其在肝纖維化中主要作用是促進細胞外基質的合成並抑制其降解。本實驗結果顯示，靈芝三萜各治療組能夠顯著下調肝組織內的TGF-β1mRNA的表達，證實了肝纖維化發生時TGF-β1基因表達是呈上調改變的，提示TGF-β1可能參與了肝纖維化的發生、發展的過程。大量研究顯示肝纖維化時，MMP-2表達是增加的[5]，當其表達增加時，可能具有降解、破壞正常基底膜的作用，使IV型膠原及其層粘連蛋白大量沉澱，促進HSC的活化，導致肝纖維化的形成[6]。本實驗運用Western-Blot方法測定肝組織中MMP-2的表達，顯示模型組MMP-2的表達較正常組明顯增加，而各治療組MMP-2的表達與模型組相比有所降低，結果證實肝纖維化時MMP-2的表達是增加的，同時提示MMP-2可能參與了肝纖維化的發生、發展，並通過適當減輕MMP-2對肝臟正常基底膜的破壞，從而間接抑制HSC的啟動，阻止肝纖維化的進一步發展。靈芝三萜可能通過下調TGF-β1mRNA以及MMP-2的表達從而阻止並改善肝纖維化。 

參考文獻

[1] 李石. 肝纖維化發生機制[J].中華消化雜誌，1999，19（1）：48.

[2] 賈克明.加強對乙型病毒性肝炎治療的研究[J].中華內科雜誌，2000，39（12）：797

[3] 謝仕斌，姚集魯.肝纖維化的診斷與治療對策[J].新醫學，1999，30（3）：177

[4] 王明宇，劉強，車慶明，等。靈芝三萜類化合物對3種小鼠肝損傷模型的影響[J]。藥學學報，2000，35（5）：326-329

[5] 李保森，遊紹莉，趙志海，等。實驗性肝纖維化形成過程中幾種基質金屬蛋白酶表達的研究[J].世界華人消化雜誌，2003，11（4）：483-485

[6] 劉詩權。基質金屬蛋白酶及其組織抑制因數和肝纖維化[J]。胃腸病學，2002，7（3）：183-185