摘要：

目的 尋找紫芝液體深層發酵液的最佳抗腫瘤活性方法。

方法 採用液體深層發酵得到菌絲體，利用小動物抑制腫瘤模型追蹤測試腫瘤活性，導向得到最佳抗腫瘤活性部位，並用苯酚-硫酸法測得其總多糖品質分數；3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定其還原糖品質分數，並對活性部位進行體外的細胞毒試驗。

結果 紫芝液體深層發酵液的最佳抗腫瘤活性部位為胞內水提醇沉得到沉澱的水溶部分（樣品B）含多糖88.4%，含還原糖3.15%，該部分不含蛋白質；在ig給藥劑量為40.5 mg/kg時，該活性部位對H22肝癌小動物的抑瘤率為63..94%，對Lewis肺癌小動物的抑瘤率為58.32%；該活性部位對A549、LoVo、CEM、QGY-7703等4種人腫瘤細胞的IC50值分別為160、29.28、45.06、37.38μg/mL。

結論 紫芝液體深層發酵液的最佳抗腫瘤活性部位為胞內水提醇沉澱可溶于水部分，對小動物抑制腫瘤有較好的抑制作用，但體外細胞毒作用較弱。

真菌被認為是抗腫瘤藥物的重要研究物件，尋找真菌中的抗腫瘤多糖成為發現抗腫瘤藥物的一個重要途徑。本課題組以動物S180肉瘤、動物H22肝癌、動物Lewis肺癌、動物C26腸癌等為模型，篩選了十餘種真菌子實體粗提取物，結果發現紫靈芝子實體多糖粗提取物顯示了很強的抗腫瘤活性，進而通過對不同產地的紫芝多糖粗提取物進行抗腫瘤活性比較，發現紫芝多糖粗提取物的抗腫瘤活性最佳。

紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 是我國名貴中藥靈芝的一種[1]，為傳統“藥食同源”的補品，具有廣泛的保健作用和悠久的使用歷史，早在《神農本草經》就把靈芝列為上品，並根據靈芝類的形態和顏色將其分為赤芝、黑芝、青芝、白芝、黃芝、紫芝6種。靈芝中使用和研究較多的是赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.Ex Fr.) Karst.[1]，國內外已對赤芝的子實體、發酵菌絲體、孢子的抗腫瘤成分進行了廣泛的研究，主要包括多糖、糖肽、三萜類等成分[2]。而對紫芝的研究較少，一個重要原因是紫芝的資源貧乏。為避免受資源制約，本實驗對所選擇的真菌採集鮮品，進一步對紫芝進行菌種分離和液體發酵培養得到菌絲體。本研究旨在尋找紫芝液體深層發酵液的抗腫瘤最佳活性部位。

1. 材料，Biotech—50BS自動發酵罐；LXJ—IIB低速大容量多管離心機；HWS26電熱恒溫水浴鍋；FD—1C—50多歧管冷凍乾燥機；全自動酶標儀；雙靈固本散；雄性小動物；動物肝癌H22、動物Lewis肺癌；細胞株：A549（人肺癌細胞）；LoVo（人腸癌細胞）；CEM（人T細胞白血病細胞）；QGY-7703（人肝癌細胞）

2. 方法與結果

2.1 選取我國山東菏澤產的新鮮紫芝進行菌種分離，對獲得的菌株採用液體深層發酵方法進行發酵，獲得菌絲體。

2.2 體內抑瘤實驗：取生長良好的動物肝癌H22腹水或Lewis肺瘤瘤塊，用生理鹽水稀釋，每只動物右腋皮下接種0.2mL，隨機分組。接種後次日起給藥，藥物體積為0.5mL/20g，癌症H22小鼠連續給藥7天，Lewis肺癌動物連續給藥10天。接種後10天解剖H22小動物，14天解剖Lewis肺癌小動物，稱取瘤塊，計算抑瘤率。

抑瘤率=(對照組平均瘤品質—給藥組平均瘤品質)/對招租平均瘤品質×100%

2.3 活性部位的確定

2.3.1  胞內胞外提取物的活性比較：發酵液離心，得胞外液（上清液）和殘渣。胞外液（上清液）濃縮，乙醇進行沉澱，抽濾，分為濾液和沉澱，將濾液減壓濃縮，乾燥至恒品質（胞外上清）；沉澱部分乾燥至恒品質（胞外沉澱）。殘渣放入燒杯，水浴提取3次，合併3次水煎液（胞內提取物），減壓濃縮，乙醇進行沉澱，抽濾，分為濾液和沉澱，濾液減壓濃縮，乾燥至恒品質（胞內上清）；沉澱部分乾燥至恒品質（胞內沉澱）。4個樣品分別ig和ip給藥，按照“相當於原發酵液的相同量”給藥，進行體內抑瘤實驗，結果見表1和2.

2.3.2 胞內水提醇沉部分可溶于水部分和不溶于水部分的活性比較：發酵液離心，上清液（胞外液）棄去，殘渣加水提取3次，合併水煎液，減壓濃縮，乙醇進行沉澱，離心濾過得沉澱；沉澱部分乾燥至恒品質，研磨成細分，得胞內提取物總沉澱。

                    表1  紫芝發酵液的胞內、胞外提取物ig給藥對肝癌H22小鼠的抑瘤作用（n=10）

        與模型組比較：*P<0.05  **P<0.01 

   *P<0.05  **P<0.01vs model group

                 表2 紫芝發酵液的胞內、胞外提取物ip給藥對肝癌H22動物的抑瘤作用（n=10）

      與模型組比較：*P<0.05  **P<0.01 

 *P<0.05  **P<0.01vs model group

樣品A（胞內提取物總沉澱）：取胞內提取物總沉澱624 mg，放入200 mL量瓶中，加少量去離子水，超聲，定容，得A的品質濃度3.12 mg/mL，按20g動物0.5 mL給藥，換算得A的給藥劑量78mg/kg。

樣品B（胞內提取物總沉澱可溶于水部分）：按相當於A的品質濃度配製，即把胞內提取物總沉澱780mg，放入250mL量瓶中，加去離子水，超聲溶解，離心，得上清液（B）和不溶物（C），按20g動物0.5mL給藥，實際樣品B的給藥劑量為40.5mg/kg

樣品C(胞內提取物總沉澱不溶于水部分):取上面不溶物(C)放入250mL量瓶，配成混懸液，得樣品C，按20g動物0.5mL給藥，實際樣品C的給藥劑量為37.5mg/kg。

按照“相當於原發酵液的相同量”給藥，進行體內抑瘤試驗，結果見表3和4。

表3 樣品A、B、C對肝癌H22動物的抑瘤作用（n=10）

與模型組比較： **P<0.01 

  **P<0.01vs model group

表4  樣品A、B、C對Lewis肺癌動物的抑瘤作用（n=10）

與模型組比較：*P<0.05  **P<0.01 

 *P<0.05  **P<0.01vs model group

2.4 體外抗腫瘤試驗：採用MTT法。把96孔板每孔都加入細胞懸液100μL，置37°C、5% CO2培養箱內。24小時後，加入樣品B液，10μL/孔，設3個複孔，37°C、5%作用72小時。每孔均加入5mg/mL的MTT溶液20μL，作用4小時後加入溶解液，100μL/孔，置培養箱內，溶解後用MK-2全自動酶標儀測570nm處吸光度值，計算IC50值。結果見表5.

表5 樣品B對A549、LoVo、QGY-7703、CEM細胞的IC50值（x的均值±s，n=3）

2.5 樣品中總糖的測定

2.5.1 葡萄糖標準曲線的測定：經測定，在6.3~21.4μg/mL吸光度（A）值與品質濃度（C）呈良好的線性關係，回歸方程為C=20.363 A—0.8017，r=0.9996。

2.5.2樣品的測定：樣品品質濃度為144.3μg/mL。樣品中有絮狀不溶物，濾過，得到上清液，測定結果見表6，樣品C由於是不溶物，沒有測得總糖。

表6 樣品A、B、C的總糖和還原糖測定結果

2.6樣品中還原糖的測定[3]

2.6.1 葡萄糖標準曲線的測定：採用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法，測定結果表明：在30~90μg/mL吸光度（A）與品質濃度（C）呈良好的線性關係，回歸方程為C=96.768A+5.6262，r=0.9995。

2.6.2 樣品還原糖的測定：樣品品質濃度配製為20.32mg/mL，還原糖的測定結果見表6，樣品C由於不是不溶物，沒有測得還原糖。

2.7 樣品中蛋白質的測定：茚三酮反應呈陰性，表明不含蛋白質；UV掃描未見280nm的蛋白特徵吸收峰。

3討論

紫芝液體深層發酵的胞內胞外提取物的抗腫瘤活性經比較，無論ig給藥iip給藥，胞內提取物在劑量小於胞外提取物一半的情況下，活性高於胞外提取物，尤其是胞內水提醇沉的沉澱，活性最好。進一步篩選，紫芝液體深層發酵的胞內水提醇沉物的沉澱，再溶于水，分為可溶于水部分和不溶于水部分，結果可溶于水部分（樣品B），而且經過分離活性成分得到了富集；總的胞內水提醇沉物的活性不如可溶于水部分，提示不溶于水部分對可溶于水部分的活性有拮抗作用或者是影響吸收。

紫芝液體深層發酵的胞內水提醇沉物可溶于水部分含總糖88.4%、含還原糖1.64%，茚三酮反應陰性，UV掃描未見280nm的蛋白質特徵吸收峰，說明該部分不含蛋白質，主要成分為多糖。該活性部位對LoVo、CEM、QGY-7703等3種人腫瘤細胞體外增殖有弱的抑制作用。

綜上所述，紫芝液體深層發酵的抗腫瘤活性部位為胞內可溶于水的多糖，但由於所得活性多糖對腫瘤細胞的細胞毒副作用較弱，而且多糖口服吸收較差，因此，該活性多糖部位的抗腫瘤作用可能是通過提高機體的免疫力來實現的，活性多糖成分的分離、純化和結構鑒定正在進一步研究中，其確切的抗腫瘤作用機制尚待進一步深入研究。

參考文獻

[1] 中國藥典 [S].一部. 2005.

[2] Paterson R R M. Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory [J]. Phytochemistry,2006,67(18):1985-2001.

[3] 葉姜瑜，談 鋒. 紫芝多糖的純化與組分分析[J]. 西南師範大學學報：自然科學版，2002，27（6）：945-949