摘 要：

目的 探討萌動啟動靈芝孢子對大鼠坐骨神經切斷再吻合後受損傷運動神經元軸突再生的影響。

方法：對單側坐骨神經切斷再吻合後的小動物給予萌動啟動靈芝孢子，通過電生理、螢光金（FG）逆行標記和組織學等方法觀察受損運動神經元軸突再生情況。

結果：坐骨神經切斷再吻合6周後，靈芝孢子組坐骨神經再生軸突的動作電位潛伏期及峰峰值的恢復率以及運動神經元胞體的螢光金逆行標記率均明顯高於對照組，靈芝孢子組小動物腓腸肌萎縮程度也輕於對照組。

結論：萌動啟動靈芝孢子能夠促進動物坐骨神經切斷再吻合後的脊髓受損傷運動神經元軸突再生。

 祖國傳統中藥用於周圍神經損傷的研究由來已久，人參、黃芪和當歸等均有促進周圍神經再生的作用。又有研究表明黨參、黃芪、丹參、銀杏葉提取物EGb和補陽還五湯等都能促進神經再生。靈芝素有“仙草”之稱，是中藥材寶庫中的珍品，萌動啟動靈芝孢子（germination-activated Ganoderma spore，GASP）是經過萌動啟動破壁等特殊加工處理的靈芝的生理細胞。此前研究發現，萌動啟動靈芝孢子可促進受損傷的脊髓運動神經元和脊髓背核神經元的存活[1]，本研究擬進一步探討其是否可以促進周圍神經再生，為臨床應用靈芝孢子治療周圍神經損傷提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料： 小動物；萌動啟動靈芝孢子，同時以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）配製、戊巴比妥鈉、螢光金；Biolap—410智慧型生物信號顯示與處理儀、XTS—4C型手術顯微鏡。

1.2 方法： 將16只小動物隨機分為靈芝孢子組（n=8）和對照組（n=8）。動物ip 1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，分離暴露動物右側坐骨神經，沿梨狀肌下緣約2mm處切斷坐骨神經，於手術顯微鏡下無創縫合線縫合坐骨神經外膜，止血後縫合創口。術後靈芝孢子組動物ig萌動啟動靈芝孢子8g/(kg.d)；對照組動物ig等量CMC。術後動物置於籠內正常飼養6周。

1.2.1 坐骨神經再生軸突的電生理檢測：坐骨神經切斷再吻合術後6周，麻醉動物後暴露手術側的坐骨神經和腓總神經。應用Biolap—410智慧型生物信號顯示與處理儀，將刺激電極放置於緊靠吻合口處的遠端，記錄電極置於腓總神經，未手術側坐骨神經在對應位置做相同檢測。電腦收集資料統計手術側和未手術側坐骨神經動作電位潛伏期及峰峰值。計算動作電位潛伏期和峰峰值恢復率。

   潛伏期恢復率=手術側動作電位潛伏期/未手術側動作電位潛伏期

   峰峰值恢復率=手術側動作電位峰峰值/未手術側動作電位峰峰值

1.2.2 螢光金逆行標記：在完成電生理檢測後於切斷問何處遠端約10mm處將3%螢光金2.5μL用微量注射器注入坐骨神經內，縫合創口，繼續飼養3天。 

1.2.3 腓腸肌濕品質測量及其組織切片的製備：螢光金逆行標記3天后，麻醉動物，取手術側和未手術側的腓腸肌稱濕品質，計算手術側肌萎縮率[肌萎縮率=（未手術側肌肉品質—手術側肌肉品質）/未手術側肌肉品質]。隨後將肌肉組織置入4%多聚甲醛（0.1mol/L PB配製，PH7.4）內固定24天，再入30%蔗糖（0.1mol/L PB配製，PH7.4）浸泡沉底。恒冷箱切片機切片，片厚10μm，HE染色。

1.2.4 動物灌注、固定和取材：動物取出腓腸後，立即經左心室主動脈插管灌注生理鹽水150mL，隨後灌注4%多聚甲醛（0.1mol/L PB配製，PH7.4）400mL固定。取L4脊髓節段、手術側吻合處和未手術側相對應處的坐骨神經，4%多聚甲醛內固定4~6天，再入30%蔗糖（0.1mol/L PB配製，PH7.4）浸泡沉底。恒冷箱切片機將L4脊髓段作連續橫切片，片厚30μm。每隔4張取1張，每只動物L4脊髓段共取10張切片。螢光顯微鏡下計數手術側被螢光金標記的運動神經元胞體數。計算運動神經元螢光金標記率=螢光金標記的運動神經元數/中性紅複染的運動神經元屬。坐骨神經于恒冷箱切片機作縱切片，片厚15μm，Mallory法染色。

1.3 資料處理：所得資料作兩獨立樣本間均數的t檢驗，資料處理均採用SPSS10.0統計分析軟體。

2 結果

2.1 坐骨神經電生理檢測：坐骨神經切斷再吻合6周後，靈芝孢子組坐骨神經動作電位潛伏期和峰峰值的恢復率分別為74.62%和39.27%，明顯高於對照組（表1）

表1 對照組和靈芝孢子組動物坐骨神經切斷再吻合6周後手術側電生理、螢光金標記和肌萎縮檢測資料的比較（x的均值±s，n=8）

與對照組比較：**P<0.01    

  **P<0.01 vs control group

 2.2 螢光金逆行標記：坐骨神經切斷再吻合6周後，對照組被螢光金標記的運動神經元胞體皺縮，其螢光較弱，神經突起少而不明顯。靈芝孢子組被螢光金標記的胞體明亮，胞體有較多向四周延伸較長的神經突起。運動神經元胞體螢光金逆行標記率靈芝孢子組明顯高於對照組（表1）

2.3 坐骨神經Mallory染色：正常坐骨神經縱切片可見排列整齊的被染成紅色的軸突和染成藍色的髓鞘、結締組織。坐骨神經切斷再吻合6周後，對照組動物的吻合處坐骨神經縱切片可見結構排列較紊亂，很少有過吻合處的軸突。而靈芝孢子組坐骨神經的縱切片上可見成紅色的排列較整齊的軸突長過吻合處。

2.4 腓腸肌濕品質及其HE染色：坐骨神經切斷再吻合6周後，兩組動物手術側後肢肌肉都有不同程度的萎縮，但靈芝孢子組動物的肌萎縮程度不如對照組的明顯（表1）。腓腸肌HE染色切片可見靈芝孢子組的肌纖維排列較整齊，肌纖維上橫紋明顯，而對照組肌纖維細小，肌纖維間隙變大，排列紊亂，橫紋不明顯。

3 討論

靈芝孢子是靈芝發育週期中的另一形態，是靈芝的生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質。靈芝孢子呈褐色卵形，具雙層壁，一般的化學和物理方法很難打破靈芝孢子的雙層壁。本研究應用的靈芝孢子是經過萌動啟動破壁等特殊處理，其活性物質更容易被利用。靈芝孢子的化學成分複雜，包括蛋白質、氨基酸類、糖肽類、維生素類、甾醇類、三萜類、脂肪酸類、內酯和微量元素等。靈芝孢子具有抑瘤和免疫調節等功能，但未有其與神經再生關係研究的報導，本課題組首次發現萌動啟動靈芝孢子亦有促進切斷再吻合的坐骨神經再生的作用。據研究表明，影響周圍神經再生的因素很多，包括神經損傷程度、炎症反應、神經營養因數和氧自由基損害等。因為靈芝孢子的靈芝蛋白[2]和靈芝多糖可以明顯調節機體的免疫反應。因此，可使機體較快地吸收損傷後潰變的組織，降低炎症反應，從而利用周圍神經再生。神經營養因數是促進神經再生的重要因素之一，其中的神經營養素-3（NT-3）能維持感覺神經元存活，促進運動神經元軸突再生和神經肌肉接頭的成熟，減輕神經損傷後肌肉的萎縮[3]。前期研究已觀察到，靈芝孢子可以明顯促進軸突損傷後的運動神經元表達NT-3，其存活率得到明顯的提高。因此本研究推測，表達NT-3的運動神經元其受損傷軸突的再生能力也可能會增強。神經損傷導致的脂質過氧化和氧自由基的增加會進一步加劇神經損傷程度。靈芝孢子含有微量元素硒（Se）和鈷（Co）。存在于谷胱甘肽過氧化物酶中的曬可與維生素E一起協同產生抗脂質過氧化作用，曬也可以抑制氧自由基的生成，通過與抗氧化劑輔酶Q的合成，保護生物膜的細胞免受過氧化物損害。而鈷通過參與形成輔酶B12利於氧的結合和釋放[4]。另外靈芝孢子中的三萜類成分也有調節免疫功能，清除氧自由基和抗脂質過氧化等作用。所以，萌動啟動靈芝孢子促進切斷再吻合後的坐骨神經再生可能是以上多種因素共同作用的結果，但其具體作用機制尚待進一步研究。 

參考文獻

[1] Ma Q T, Zeng Y S, Zhang W, et al. Effects of Ganoderma spore and L-NNA on the neuronal survival and axonal regeneration in Clarke’s nucleus and red nucleus after rat spinal cord injury [J]. Acta Anat Sin（解剖系統）,2005,36(6):597-603.

[2] Ye B P, Wang Q H, Zhou S J, et al. Isolating of proteins from Lingzhi and study on its immune activity [J].Pharm Biotechnol (藥物生物技術),2002,9(3):150-152

[3] Novikova L N, Novikov L N, Kellerth J O. Survival effects of BDNF and NT-3 on axotomized rubrospinal neurons depend on the temporal pattern of neurotrophin administration [J]. Eur J Neurosci ,2000,12(2):776-780

[4] Luo Z M. Analysis on the content of trace elements in Ganoderma spore and its pharmacology and clinical application [J].Guangdong Trace Elem Sci (廣東微量元素科學)，2003，10（8）：42-48.