（1.          北京師範大學資源學院，北京 100875;

（2.          北京中醫藥大學東直門醫院 中醫內科學教育部重點實驗室，北京 100700）

     研究表明腦組織缺血性損傷過程中存在著神經細胞凋亡[1]，且神經細胞凋亡在缺血性腦損傷中起十分重要的作用。藥物可通過干預神經細胞凋亡過程阻止缺血性損傷的進一步發展，而發揮對神經細胞損傷的保護作用。細胞內Ca2+超載是缺血性腦損傷的發病機制之一，在缺血後神經元凋亡發生中也起關鍵作用，而鈣離子抑制劑或藥物可抑制細胞內Ca2+濃度（[Ca2+]i）升高，可阻止凋亡的發生[2]。丹參素是丹參的有效活性成分，具有抗缺血缺氧、抗自由基、抑制細胞內[Ca2+]i升高等作用[2]，臨床上丹參被廣泛用於治療缺血性心腦血管疾病，但對其作用機制缺乏深入研究。本實驗通過缺糖-缺氧細胞損傷模型觀察丹參素對神經細胞凋亡及細胞內[Ca2+]i變化等相關因素的影響，探討其對神經細胞保護作用的機制。

1材料與方法

1.1神經細胞系：SH-SY5Y由武漢大學典型培養物保藏中心提供

1.2 藥品與試劑：MEM培養基；新生牛血清；碘化丙啶；Fluo-3、Rhodamine123；連二亞硫酸鈉（Na2SO4）。丹參素。尼莫地平。

1.3 SH-SY5Y 細胞的缺糖-缺氧模型製備及分組：將凍存的SH-SY5Y細胞株從—196°液氫罐中取出，細胞常規復蘇及傳代，計數細胞並稀釋，接種于25 mL培養瓶中（5 mL）。隨機分為5組：缺糖-缺氧模型組，用無糖Earle’s液[含（mmol/L）Nacl 143、KCl 5.4、CaCl2 21.8、MgSO4 10、Na2PO4 1.0、HEPES 2.4，PH 7.4]洗細胞2次，加入含0.3 mmol/L連二亞硫酸鈉的無糖Earle’s液；正常對照組：細胞不經缺糖-缺氧損傷處理；尼莫地平組：100μmol/L尼莫地平於缺糖-缺氧損傷時加入培養液中；丹參素組：于缺糖-缺氧損傷時加入丹參素（品質終濃度分別為15、30 mg/L）。各組細胞處理後置50%CO2、37°培養箱中分別培養2、4、6、12h，收集細胞進行相關實驗。

1.4 凋亡細胞計數：收集細胞懸液，1000×g離心5min，棄上清液，沉澱用70%乙醇懸浮，4°冰箱內固定12h以上。取固定後的細胞用0.1mmol/?磷酸鹽緩衝液（PH 7.4）洗2遍並懸浮，加入品質終濃度為20mg/L RNase A，37°恒浴1h，再加入PI染液50 mg/L，搖勻後4°避光靜置1h，經尼龍網濾過，在FACS Calibur型流式細胞儀上計數10000個細胞，測定各期細胞DNA含量並計算凋亡細胞所占比例。

1.5 細胞形態學觀察：參照文獻方法。細胞用Hoechst3342和PI雙染色15min，用磷酸緩衝液PBS洗1次，重懸於PBS中。用螢光顯微鏡觀察。

1.6 乳酸脫氫酶（LDH）釋放的測定：用LDH試劑盒（北京化學試劑公司提供）測定培養液中LDH含量，並將相應的培養細胞置於-30°，3h以上，融解後以同法測定總LDH。神經細胞損傷程度以培養細胞釋放的LDH占總LDH的百分比表示。

1.7 細胞[Ca2+]i的測定：收集細胞，100r/min離心5min，棄上清液，用新鮮培養基重懸細胞，加入Fluo-3(50μmol/L)的無血清MEM，37°、45min，PBS洗細胞3次，取細胞懸液1mL，過200目尼龍網，在流式細胞儀上用LOG軟體分析，繪製Ca2+的平均螢光值分佈圖。其中橫坐標為鈣離子平均螢光值的對數值，縱坐標為細胞體積。Fluo-3是新一代細胞膜透性的Ca2+特異性螢光燃料，其與細胞內游離Ca2+結合後發出螢光，直接以螢光強度變化表示細胞內游離Ca2+變化（激發光波長480 nm，發射光波長530 nm和620 nm）。

2.結果

2.1 丹參素對LDH釋放的影響：缺糖-缺氧損傷後2h細胞釋放LDH顯著增加，並隨損傷時間的延長而增加，丹參素能夠減少LDH的釋放，並隨著劑量的增加而作用增強，見表1。 

表1 丹參素對LDH釋放的影響（x的均值±s,n=8）

與模型組比較：*P<0.05  **P<0.01

       *P<0.05  **P<0.01 vs model group

2.2 丹參素對細胞[Ca2+]i的影響:正常對照組細胞在不同時間內鈣離子含量及分佈較穩定。缺糖-缺氧損傷不同時間後，細胞內[Ca2+]i明顯增加，並隨損傷時間延長而增加，尼莫地平明顯減少Ca2+的過量產生，丹參素能抑制或減少Ca2+的過量產生，隨濃度增加作用增強，與模型組相比差異顯著（P<0.05，0.01），見表2。

2.3 丹參素對神經細胞凋亡的影響：缺糖-缺氧損傷不同時間後，細胞凋亡發生率明顯增高，並隨損傷時間的延長，凋亡的細胞增多，尼莫地平能夠拮抗這種作用，丹參素能抑制細胞凋亡的發生，與模型組相比差異顯著，並隨機靈的增加抑制作用更加明顯，與尼莫地平組相比差異不顯著（P>0.05），見表3。

2.4 丹參素對神經細胞形態及細胞壞死的影響：Hoechst33342和PI雙染色檢測是在螢光顯微鏡下可觀察到正常細胞發藍色螢光，染色質均勻分佈，凋亡小體產生，壞死細胞發紅色螢光。正常對照組只可見少量的凋亡細胞和極少量的壞死細胞。缺糖-缺氧損傷後，可見大量的凋亡細胞及少量壞死細胞，並隨損傷時間的延長而凋亡細胞及壞死細胞均增加，以凋亡細胞為主，加入丹參素及尼莫地平後，凋亡及壞死細胞均明顯減少，見表4。 

表2 丹參素對細胞[Ca2+]i的影響（x的均值±s,n=8）

與模型組比較：*P<0.05  **P<0.01

     *P<0.05  **P<0.01 vs model group

表3 丹參素對神經細胞凋亡的影響（x的均值±s,n=8）

與模型組比較：*P<0.05  **P<0.01

     *P<0.05  **P<0.01 vs model group

表4 丹參素對細胞[Ca2+]i的影響（x的均值±s,n=8）

與模型組比較：*P<0.05  **P<0.01

     *P<0.05  **P<0.01 vs model group

3.討論

缺血再灌注性腦損傷所致的神經細胞死亡有壞死和凋亡兩種方式，在腦缺血-缺氧早期引起的神經元死亡主要以壞死為主，而繼發性或遲發性神經元死亡則以凋亡為株。缺血性再灌注腦損傷時神經細胞凋亡和壞死並存，共同參與梗死區的形成，凋亡主要位於半暗區，壞死發生於缺血中心區，抑制半暗區向缺血中心區的發展是缺血性腦血管病治療的關鍵，即抑制神經細胞凋亡的發生有利於缺血性腦血管疾病的治療。 

腦缺血再灌注後細胞內鈣穩態異常，大量Ca2+蓄積在細胞內產生嚴重的毒性作用，參與興奮性神經毒、自由基等因素介導的DND的病理級聯反應，導致神經細胞功能與結構的障礙。缺血損傷引起了大腦不同區域的細胞內鈣集聚，尤其在海馬更明顯。腦缺血再灌注後神經元鈣穩態的維持，是細胞生存的關鍵。細胞[Ca2+]i升高被認為是凋亡的始動因素。有研究表明各種原因誘導的細胞凋亡出現之前，胞漿內游離Ca2+濃度均持續升高，抑制Ca2+濃度的升高則可阻止誘導的細胞發生凋亡[1]。在胎屬皮層神經元培養液中加入Ca2+載體，是細胞[Ca2+]i升高，誘發了神經元凋亡，提示Ca2+與遲發性神經元凋亡有關[2]。大量實驗證明：阻止Ca2+內流可明顯減輕細胞損傷的程度。 

SH-SY5Y細胞來源於人的神經母細胞瘤，細胞的形態與正常神經元相似，呈錐形，而且具有明顯的軸突，某些生理功能亦與正常神經元有相似之處，是目前國際上研究神經細胞功能較好的一種細胞模型[3]。本實驗以培養神經細胞SH-SY5Y缺糖-缺氧損傷為模型，類比腦缺血狀態，誘導培養的SH-SY5Y細胞凋亡的發生。結果發現，隨著缺糖-缺氧損傷時間的延長，細胞[Ca2+]i隨之明顯增高，細胞凋亡的發生葉越來越多，壞死的細胞也增多，代表細胞損傷程度的LDH的釋放也越來越多。丹參素能明顯改善這種情況，是LDH的釋放、細胞[Ca2+]i水準、細胞凋亡及壞死的百分率均明顯降低，對缺血性損傷的神經細胞有保護作用。尼莫地平是L型鈣通道阻斷劑，能阻止, Ca2+跨膜內流，抑制細胞內Ca2+的釋放，使細胞Ca2+保持在一定的水準。丹參素降低缺糖-缺氧損傷後SH-SY5Y細胞[Ca2+]i水準的效應與尼莫地平相仿。試驗結果提示丹參素對缺糖-缺氧損傷後SH-SY5Y細胞的凋亡過程具有抑制作用，神經細胞具有保護作用，這種作用可能與其抑制神經細胞內鈣超載有關，但丹參素的作用機制是影響細胞外鈣的內流，還是調整細胞內鈣庫的釋放，尚需進一步研究。 

文獻資料

[1] Tenneti L D,Emilia D M, Lipton S A. Suppression of neuron apoptosis by S-nitroslation of caspases [J]. Neurosci Lett,1997,236(3):139-142.

[2] Takel N, Endo Y. Ca2+  ionophre-induced  apoptosis on cultural embryonic rat cortical neurons[J].Brain Res,1994,652(1):65-70.

[3] Ghatan S, Larner S,Kinoshita Y,et al.p38 MAP Kinase mediates bax translocation in nitric oxide-induced apoptosis in neurons[J].Cell Biol,2000,150(2):335-347.