摘 要：
目的 探討葛根素防治慢性低氧高二氧化碳肺動脈高壓大鼠右心室的效應是否與新的小分子活性肽Apelin及其受體(APJ)有關。
方法 清潔級SD雄性大鼠30只，隨機分為對照組、低氧高二氧化碳模型組和葛根素。放免法測定血漿的Apelin-36水準，RT=PCR檢測右心室組織Apelin與APJ MRNA表達。
結果右心室與左心室間隔的品質比{RV/?(LV+S)}:模型組明顯高於對照組（P ＜ 0.01）而葛根素組明顯低於模型組（P＜0.01）,平均肺動脈壓（MPAP）：模型組明顯高於對照組（P＜0.01）而葛根素明顯低於模型組（P＜0.05）;平均頸動脈壓(MCAP)各組間無明顯統計學意義（P＞0.05）。血漿APELIN-36水準：模型組明顯高於對照組（P＜0.01）葛根素組高於模型組（P＜0.05）右心室肌均漿APELIN-36水準：模型組明顯高於對照組（P＜0.05），葛根素組又明顯比模型組高（P＜0.01）.右心室肌APELIN MRNA水準。模型組明顯低於對照組（P＜0.05）而葛根素組顯著高於模型組（P＜0.01）右心室肌APJ MRNA:模型組低於對照組（P＜0.05）而葛根素組高於模型組（P＜0.05）。
結論 葛根素防治低於高二氧化碳肺動脈高壓大鼠右心室肥大的機制可能部分與調節Apelin/APJ系統有關。
慢性低氧性肺動脈高亞是慢性阻塞性肺部疾病向肺心病發展的關鍵環節。低氧性肺動脈高壓、有心室肥大的大病機制十分複雜，迄今尚不完全明確。其中，書縮血管的穩態調節因數起著重要作用。Apelin的新發現的小分子活性多肽，受體為G蛋白 –血管緊張素受體AT-1相關的受體蛋白（APJ）。Aplelin/APJ廣泛分佈與哺乳動物與人的多種組織（腦、肺、心血管等）對正常與病變心臟都具有正性肌力、舒張血管、降低血壓的血管保護作用。初步研究表明肺動脈高壓致右心房肥大血漿Apelin水平均降低，其生成減少和/或代謝異常可能是導致穩態失衡的重要因素之一，推測Apelin參與了肺動脈高壓、右心房肥大的發生和發展[1]。
葛根素系豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi乾燥根中的有效部分，具有擴張冠狀動脈、改善微循環、清除氧自由基、抑制平滑肌細胞增生等作用，已廣泛應用與心腦血管及肺部疾病的治療[2]，前期研究發現葛根素有叫降低慢性低氧大鼠肺動脈壓、改善肺血管改建的作用，但機制尚未完全明確，本研究慢性低氧高二氧化碳肺動脈高壓大鼠模型上，觀察葛根素對Apelin/APJ信號系統的影響，在進一步探討葛根素對肺動脈高壓大鼠右心室肥大的防治及其機制，為拓展其臨床用途供實驗依據。
1 材料
1.1 藥物：葛根素注射液（天保康），由浙江康恩貝只要股份有限公司提供，批號 051004。
1.2 動物：清潔機雄性SD大鼠，體重180~220g由溫州醫學院實驗動物中心提供，許可證號SYXK（浙）2005-0061。
1.3 儀器：常低氧高二氧化碳清潔機動物飼養，自製；CYESII型O2 CO2氣體測定儀，上海市嘉定聯儀錶廠；Ultra—Turex T25均漿器，美國；GENE GEBIUS疑膠成像儀，美國；Wallace 1470 Wizard全自動放免計數儀，德國；Powerlab生理記錄儀，澳大利亞。
1.4 試劑：Apelin—36放免試劑盒購自Phoenix Pharmaceutical INC (美國)；抑肽酶Apr公司購自Sigma公司；Trizol購自Gibco BRL（美國）；DNTP購自ClontechCo（美國）mMuLV逆轉錄酶、Taq酶、RNAsin 和 Oligo (Dt)15Primer 購自 promega Co 美國 PCR物由賽百盛公司合成；其餘試劑為市售分析純。
2 方法
2.1 慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓大鼠右心室肥大模型的製備：30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和葛根素組。將後兩組大鼠放入常低氧高二氧化氮動物飼養艙內，艙內吸入氣氧氣體體積分數為9‰~11‰二氧化碳體積分數為5‰~6‰， 每天9h，每週6d連續飼養4周，葛根素組每天進艙前30min ip葛根素（20mg/kg）對照組、模型組ip等量的生理鹽水。
2.2 肺動脈壓、頸動脈呀、右心室與左心室加室間隔品質比的測定：動物飼養4周後，行頸正中切口，分離又頸外靜脈和左頸總動脈。採用右心導管法自又頸外靜脈插管至肺動脈，並行左頸總動脈插管，分別接入Powerlab生理記錄儀，記錄平均肺動脈壓、平均頸動脈壓。放血處死動物，迅速剪開胸腔取出心肺。將右下肺置於4‰多聚甲中固定，其餘肺組織置於-80C液氮內冷凍。減去右心房組織，分別稱取右心室游離壁(RV)和左心室間隔（LV+S）的品質，計算出RV與(RV+S)的品質比，作為右心室肥大的指標。
2.3 血漿和右心室肌漿Apelin-36水準的測定
2.3.1 製備血漿樣本：頸動脈血2ml置於含EDTA—NA2的抗疑管中，4C、4000r/min離心10min取上清加入10抑肽酶，於---80C冰箱保存待測。
2.3.2 製備右心室組織漿樣本：右心室肌約100mg置於1mol/L中煮沸10min冷卻後，用Ultra----Turex T25漿器製備4C，3000r/min離心20min，取上清—30c保存待測。
2.3.3 標本檢測：所有的檢測均在1次試驗中完成，按放射免疫分析試劑盒說明操作測定Apelin-36水準；其半抑制濃度為26pg/管，與Apelin—36 Apelin16 Apelin13 Apelin12（鼠 牛）交叉反應性100％，結合率為25％，實驗按說明書操作。
2.4右心室組織中的Apelin mRNA/APJ mRNA的提取及測定
2.4.1 總RNA的提取：取部分右心室肌約100mg（提取總RNA和製備漿所需的右心室組織各取同一大鼠的部分心肌），採用Trizol一步提取法提取心室肌總RNA。各總RNA樣本A260/A280值為1.8~2.0.
2.4.2擴曾引物設計與合成：PCR引物由賽百盛公司合成，以大鼠作為內參照物。引物序列見表1.
2.4.3PCR反映條件：95C預變性5min，94min，變形30s退火30 s ，72延伸40s，熱迴圈，最後72C延伸5min擴曾產物行瓊脂糖疑電泳，成像儀分析結果，目的基因mRNA的相對表達量以目的的片段與相應的吸光值的比值表示。重複3次獨立實驗。
3 結果
3.1 葛根素對慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓大鼠Mpap、RV/(LV+S)及mCAP的影響：模型組mPAP比對照組升高51.90％（P＜0.01）而葛根素組比模型組降低26.49％（P＜0.05）模型組RV/(LV+S)比對照組升高35.44％（P＜0.01）而葛根素組比模型組降低19.85％（P＜0.01）各組大鼠mCAP差異無統計學意義（P＞0.05）
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組別 劑量/ mPAP/ Mcap/ {RV/(LV+S)}/
Mg .kg mmHg mmHg ％
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對照 -- 15.51±2.91 118.6±11.2 23.25±2.18
模型 -- 23.56±3.72 125.3±10.3 31.49±3.12
葛根素 20 17.32±3.68 128.3±25.2 25.24±3.19
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3.2 葛根素對慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓大鼠血漿和右心室心肌Apelin-36比對照組升高69.27％（P＜0.01）葛根素組又比模型組升高14.55％（P＜0.05）；模型組右心室肌比對照組升高21.49％（P＜0.05）,葛根素比模型組升高65.96％（P＜0.01）見表3
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組別 劑量/（mg .kg） 血漿/(pg .ml) 右心室肌/(pg .mg)
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對照 -- 410±78 6.19±1.09
模型 -- 694±120 7.52±1.25
葛根素 20 795±73 12.48±1.04
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3.3葛根素對慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓大鼠右心室肌中Apelin Mrna/APJ mRNA表達的影響：模型組Apelin表達水準比對照組降低34.57％（P＜0.05）而葛根素比模型上升96.68％（P＜0.01）模型組APJMRNA比對照組降低28.00％（P＜0.05）而葛根素組比模型組升高63.06％（P＜0.05）
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組別
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mRNA表達水準
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Apelin APJ
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對照 -- 1.325±0.190 0.962±0.236
模型 -- 0.867±0.072 0.692±0.176
葛根素 20 1.705±0.268 1.129±0.119
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4 討論
Apelin是新近發現的小分子活性肽，慢性缺氧時右心室組織中Apelin/APJ系統的改變可能是右心室肥大及功能障礙的重要機制[3]。葛根素已廣泛應用於治療心腦血管疾病，大量研究工作表明，葛根素能有效降低慢性低氧高二氧化碳性大鼠的肺動脈高壓及右心室肥大。葛根素降低肺動脈壓、防治右心室肥大的作用是否與Apelin/APJ系統有關，尚未見有報導。
本實驗所採用的間斷常低氧高二氧化碳性大鼠模型，類似於慢性阻塞性肺部疾病的患者，由於通氣功能障礙常導致肺胞低氧和二氧化碳，以往眾多的研究只考慮了低氧因素，選用慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓模型可能更符合臨床實際。
Apelin時一重要的具有內源性保護作用的生理調節肽，具有舒張血管、正性肌力等廣泛的作用。Apelin-36水平均明顯上調，mPAP和RV(LV+S)也明顯高於對照組，這可能與低氧時代償性的Apelin釋放相對不足有關。同時，慢性低氧高二氧化碳性大鼠肺動脈高壓和右心室肥大形成過程中，還有大量的縮學管與促增物質的參考。實驗發現，慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓大鼠右心室組織Apelin mRNA和APJ mRNA的表達均下調。Apelin基因水準與蛋白水準表達的不一致，這可能與基因轉錄、蛋白質翻譯、修飾中的某個環節有關係，其具體機制還不清除。Szokodi等研究發現，機械牽拉培養的新生樹鼠心室肌細胞及慢性左心室內壓超負荷的整體動物模型中Apelin mRNA表達顯著下調，提示機械應力參與了Apelin mRNA表達的調控。慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓使右心室壓力負荷增加有關。此外，在先前實驗中的低氧1周、2周肺動脈高壓大鼠模型上和慢性肺動脈高壓的病人上，觀察到血漿與右心室組織漿中Apelin—36的蛋白表達下調；而在本實驗所採用的低氧高二氧化碳4周肺動脈高壓大鼠模型上卻發現Apelin蛋白表達上調。推測Apelin表達的水準在疾病發生發展的過程中的不同階段可能有著不同的變化與意義；在肺動脈高壓晚期，血漿Apelin可能表現為顯著下降。有文獻報導Apelin的下降可作為判斷肺動脈高壓疾病嚴重程度的指標。
在前期試驗中曾觀察不同劑量（10、20、40mg/kg）的葛根素對慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓大鼠的影響，發現中劑量20mg/kg的效果最佳，故在本本實驗中僅採用了該劑量。實驗結果顯示，葛根素組與模型組大鼠相比，mPAP、RV/(LV+S)明顯下調，提示葛根素注射液具有降低慢性低氧高二氧化碳肺動脈高壓和右心室肥大的作用，與以往的研究相符。在本實驗中首次發現，葛根素可進一步提高低氧大鼠右心室組織與血漿的Apelin蛋白水準。同時，上調右心室組織中Apelin mRNA/APJ mRNA的表達。最為內源性變力物質的Apelin，同時可抑制心肌細胞肥大。據此，推測葛根素能促進肺動脈高壓大鼠血漿與右心室中的Apelin蛋白表達，上調右心室組織中的Apelin Mrna\APJ mRNA表達。這可能時葛根素防治低氧高二氧化碳肺動脈高壓大鼠右心室肥大、改善右心室功能作用機制之一。
綜上所述，葛根素具有防治低氧高二氧化碳性肺動脈高壓與右心室肥大的作用，該作用至少部分是調節Apelin/APJ系統的表達來實現的，而其具體的調節機制尚有待進一步探討。
參考文獻
[1] 項中一，李玉萍，陳少賢，等。肺動脈高壓患者血漿Apelin的變化及意義[J]。放射免疫學雜誌，2006，19（4）：262-264.
[2] 陳少賢，姜琴華，王良興，等。葛根素對急性肺血栓栓塞溶栓治療後再灌注損傷的影響[J].中國藥理學通報，2004，20（11）：1245-1250.
[3]龔永生，高鈺琪，吳洲，等。慢性缺氧性肺動脈高壓大鼠右心室基因表達降低[J]。西南國防醫院，2006，16（2）：158-160.
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