摘要：
目的 研究葛根素對體外培養血管環血管生成作用。
方法 採用小動物胸主動脈環，纖維蛋白原包埋于48孔板中，含5%牛血清和不同濃度葛根素的MCDB131培養液培養，陽性藥用內皮細胞生長因數，顯微鏡下記數新生微血管數量。
結果 主動脈環生長良好，第4天血管芽開始從動脈壁長出，5~14d進入生長期。第14天，陽性藥組平均新生血管數與空白對照組比較明顯增多；葛根素12.5~100цg/mL各給藥組與空白對照組比較平均新生血管明顯增多，除100цg/mL組外，其餘各組隨著濃度的升高血管數有所增加。
結論 葛根素有明顯促進體外培養動物胸主動脈環血管生成的作用，並有一定的劑量依賴性。
葛根素（puerarin）是豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd)Ohwi或甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth）.根中提取的一種黃酮苷。自1992年批准上市以來，人們對葛根素的研究抑制比較活潑，在藥品和保健品中應用廣泛，已開發出注射劑、膠囊、片劑和滴眼劑等多種製劑，臨床應用於冠心病、心絞痛、心肌梗死、心律失常、高血壓、視網膜動靜脈阻塞、突發性耳聾、高血脂和高血糖等，療效顯著[1]。但葛根素治療心肌缺血的確切機制至今沒有完全清除。刺激缺血區小血管生長，促進側枝迴圈的形成，完成缺血區血管的自我搭橋的血管生成方法成了十分有人且似乎直觀合理的治療方法，其前景看好，因此，本實驗通過研究葛根素對體外培養動脈環血管生成的影響，探討其治療心肌缺血的作用機制。
1. 材料
1.1 實驗動物、藥品、試劑及儀器：小動物；葛根素；牛纖維蛋白原、MCDB 131培養基、牛凝血酶、6-氨基已酸、內皮細胞生長因數、胎牛血清；48孔板、超淨台、培養箱等。
2. 溶液配製
2.1 纖維蛋白原溶液：纖維蛋白原溶解於MCDB131無血清培養液中，品質濃度3g/L。
2.2 牛凝血酶溶液：牛凝血酶溶解於滅菌的蒸餾水中，濃度為50NIHU/mL
2.3 D-Hanks液：氯化鈉8.0g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4·H2O）0.06g，氯化鉀0.4g，磷酸二氫鉀0.06g，碳酸氫鈉0.35g溶解于三蒸水1000mL中，高溫滅菌後4°C備用。
3. 試驗方法
根據Nicosia和Brown等報導的方法稍加改進。無菌條件下取小動物胸主動脈，立即放入D-Hanks液中，在解剖顯微鏡觀察下，去除血管外纖維和脂肪組織，切成2mm長的動脈環，置D-Hanks液中沖洗數次備用，48孔板每孔加入10μL 50NIH U/mL牛凝血酶溶液，然後加入0.4mL的3g/L纖維蛋白原溶液，立即垂直放入動脈環，使其沉于底部正中部位。大約10min，纖維蛋白凝固。預實驗過程中，在孔中加入含有不同濃度胎牛血清的MCDB131培養液，在培養液中加入抑制纖維蛋白水解的6-氨基已酸150μg/mL，每3天換液一次。放入培養箱中培養動脈環，隔天根據報導的方法[2]觀察動脈環血管生成的情況並計數。血管生長的分枝頂點被認為分枝形成。計數微血管生成的原則：（a）根據內皮細胞的結構特徵（胞體扁長,黏連性生長），區分血管的“出芽”與纖維原細胞；（b）新生血管的分枝算作一個新的血管形成；（c）每一個環計數為2葛新生血管，因為它被認為是2個趨酮的血管相接的。根據預實驗結果，選擇含5%血清的MCDB131培養基培養動物主動脈環。實驗分為7組，空白對照組用含5%血清的MCDB131培養基培養，陽性藥組用含5%血清的MCDB131培養基+內皮細胞生長因數VEGF30mg/mL培養，葛根素組用5%血清的MCDB131培養基+不同品質濃度葛根素（100、50、25、12.5、6.25μg/mL）培養，方法同前述。隔天技術新生血管數。實驗重複3次。
4. 統計學處理
所有資料用x的均值±s表示，各組之間的比較採用統計軟體SPSS10.0 One-Way ANOVE方法。
5. 試驗結果
預試驗結果顯示，血管數隨血清濃度增加而增加。在血清小於5%的情況下，血管幾乎沒有生長，而當血清大於8%的情況下，血管生長非常迅速，培養6~7d即可長滿整個培養孔。故選擇含5%血清的培養基動物主動脈。培養4天后，可觀察到動脈環周圍有大量的內皮細胞遷移、增殖，血管芽開始從動脈壁長出；第6~13天進入生長期，第14天，陽性藥組平均新生血管數與空白對照組比較明顯增多，統計學有顯著性差異（P<0.005）；葛根素12.5~100μg/mL各組與空白對照組比較平均新生血管數明顯增多，統計學有顯著性差異（P<0.05、0.01），與陽性藥組比較無顯著性差異（P>0.05），除100μg/mL組外，其餘各組隨著品質濃度的升高血管數有所增加，但經統計學處理無顯著差異（P>0.05），見表1.
表1 葛根素對培養動物胸大動脈血管生成的影響
|
組別
|
劑量/(μg.mL-1)
|
血管環數/個
|
微血管/個
|
|
對照組
|
—
|
8
|
70.25±85.79
|
|
VEGF組
|
3×（10的5次方）
|
8
|
142.50±54.93*
|
|
葛根素組
|
100
|
7
|
141.28±75.38*
|
|
|
50
|
8
|
177.30±35.77**
|
|
|
25
|
7
|
157.00±91.88*
|
|
|
12.5
|
8
|
151.50±52.47*
|
|
|
6.25
|
8
|
134.12±72.22
|
與對照組比較：*P<0.05 **P<0.01
*P<0.05 **P<0.01 vs model group
6. 討論
冠心病是冠狀動脈性心臟病的簡稱，是一種由於冠狀動脈固定性（動脈粥樣硬化）或動力性（血管痙攣）狹窄或阻塞，發生冠狀迴圈障礙，引起心肌氧供需失衡而導致心肌卻學缺氧或壞死的一種心臟病，亦稱缺血性心臟病。儘管在預防性衛生保健、藥物治療以及外科手術等方面有了很大的發展，但是冠心病的發病率和死亡率仍然居高不下。
自從Folkman提出雪光生成的概念以後，在血管生成的體內研究模型通常使用雞胚絨毛膜尿囊、倉鼠頰窩、兔角膜等組織器官實驗模型，在體外主要採用培養內皮細胞模型，檢測血管生成因數對內皮細胞增殖、遷移以及一些主要酶的活性的影響，組織培養也被採用，主要是研究孤立的內皮細胞在細胞外基質和血管生成因數作用下形成微血管的作用，但是在這些在體和離體實驗中都存在一些問題，在體外實驗中主要是來源於血清或血漿的一些不能確定的因數對實驗的不確定性影響，以及用孤立培養的皮內細胞研究微血管形成僅僅能部分類比血管壁的形成，並且用此模型無法解釋內皮細胞與血管周圍細胞如周細胞、平滑肌細胞、纖維原細胞之間的相互關係；在體實驗過程中的炎症反應可以促進淋巴細胞和單核細胞釋放一些血管生成因數而干擾實驗過程，因此需要一種便利的能提供完全清晰的血管生長環境的模型。動脈環體外培養生成血管的方法最先有Nicosia在1982年提出，隨後在1990年改進為一個定量模型，此模型採用無血清培養基在膠原質、血凝塊或纖維蛋白原膠上培養大鼠主動脈血管環，從而形成由內皮細胞的“出芽”和“分支”組成的微血管網，定量計數新生成的微血管結構，並繪製生長曲線。
在此 ，動脈環培養模型作為一個研究血管生成廉價而方便的模型得到了廣泛的接受和發展，尤其是Wang等[3]和Blacher等因為電腦輔助的圖像分析技術以後，微血管的定量測量就更加簡單、方便、準確，能使人們更好的理解血管形成的過程和更方便篩選促進和抑制血管生成的活性化合物。這個模型建立了血管生成體內模型和體外模型之間的橋樑。本研究根據實驗需要和實驗條件，對上述實驗方法進行了改進，用不同濃度的血清對動物動脈血管環進行了培養，結果顯示，在無血清或血清濃度小於5%的情況下，血管環幾乎不能生成新的血管，隨著血清濃度不斷地增加，直到長滿整個培養板。由於進行的是促進血管生成的實驗研究，為了最大程度上減少血清以及其中因數促進血管生成的干擾，選擇了能生成新生血管最小血清濃度（5%血清的培養基）的環境下培養血管環，觀察不同品質濃度的葛根素對培養血管環血管生成的促進作用。在這個過程中，應用30μg/mL的內皮細胞生長補充劑作為陽性對照，結果顯示，培養4天后，在顯微鏡下能明顯觀察到動脈環周圍有大量的內皮細胞遷移、增殖，血管芽尅是從動脈壁長出；第6~13天進入生長期，血管不斷的分枝，最後形成微血管網，技術定量結果顯示，陽性對照組血管生成數明細那多於空白對照組，統計學有顯著性差異，由此說明動物動脈環培養實驗模型的建立是成功的。並且在記數過程中採用統一標準，用雙盲的辦法，是定量客觀、準確。
實驗研究和臨床研究均顯示，葛根素治療心肌缺血有肯定的療效，並且能促進內皮細胞的增殖[4]，對各種原因引起的內皮細胞的損傷有保護的作用，抑制其凋亡[5]，推薦哦那個是葛根素可能通過升高NOS活性調節血管內皮依賴性舒張因數即NO的作用。內皮細胞和NO分子都在血管生成過程中起關鍵性作用。同時劉啟功等，最近體外實驗還證明葛根素0.5mmol/L就能增加內皮祖細胞（EPC）的數量，並呈一定的量效關係；3mmol/L葛根素作用12小時到高峰，EPC可以通過血管發生呢個（vasculogenesis）的機制促進新生血管的生成，同時EPC能分裂為成熟的內皮細胞的功能，促進其增殖、遷移和血管生成，而且能增加EPC的數量並改善其功能，從而促進內皮的修復，改善冠心病患者的臨川症狀和預後。本研究也顯示，葛根素12.5~100цg/mL均能明顯促進體外培養的血管環新生血管的生成，並且有一定的劑量依賴性。由此可見，葛根素抗心肌缺血作用可以通過誘導缺血區血管的新生，改善缺血區血液供應，達到治療的目的。其在心肌缺血動物模型上促血管生成作用及其分子機制進一步明確後，將為臨床的進一步廣泛應用提供基礎。
參考文獻
[1] Mao C P, Gu Z L. The pharmacological and clinical on study puerarin [J]. Chin J Hemorheol (中國血液流變學雜誌),2004,14
(3):138-142.
[2] Duda D G, Fukumura D, Jain R K. Role of eNOS in neovas-cularization : NO for endothelial progenitor cells [J]. Trends Mol
Med,2004,10(4):143-145
[3] Wang H S, Hwang L L, Sue L F, et al. A simple quantitative method for evaluation of angiogenesis activity[J]. Assay Drug
Dev Technol,2004,2(1):31-38.
[4] Li Y, Fan Y C. Proliferative effect of puerarin on human endothelial cell from umbilical veins[J]. China J Tradit Med Pharm(中國
醫藥學報),2004,2(11):448-449
[5] Xu M C, Xiao S Z, Sun Y H,et al.The study of antimetabolic syndrome effect of puerarin in vitro [J]. Life Sci, 2005,77
(25):3183-3196.
|
