摘 要：

     目的  觀察葛根素對遺傳性視網膜色素變性rds小鼠的治療作用，並探討其抗視網膜光感受器細胞調亡的作用機制。

    方法：rds新生小鼠隨機分為兩組，實驗組和對照組。實驗組小鼠從出生時開始ip，鹽酸葛根素80mg/kg，每天2次，至生後35d，對照組同時ip等量生理鹽水。分別在用藥後0、3、7、14、21、28、35d取眼球，立即經10%中性甲醛固定，常規病理切片。另取眼球2.5%戊二醛溶液固定，電鏡觀察。用TUNEL方法檢測視網膜光感受器細胞的調亡，用免疫組化方法測定Bcl-2在視網膜的表達。

    結果 病理結果顯示，經葛根素治療後14、21、28、35d，rds小鼠光感受器細胞層數與對照組比較，明顯增加（P<0.01）。電鏡結果顯示，葛根素治療組與對照組比較，在7、14、21、28、35d可減輕rds小鼠光感受器組胞及其外段盤膜部位的線粒、盤膜和外界膜的破壞。Rds小鼠經葛根素藥物治療後3、7、14、21、28、35d，光感受器細胞的凋亡率與對對照組比較明顯減少；在7、14、21、28、35d，Bcl-2在視網膜感受器細胞基質及其內處段的表達明顯增強。

    結論 葛根素可減輕rds小鼠視網膜光感受器細胞的病變,其作用機制可能是通過上調視網膜光感受器細胞及其內外段Bcl-2的表達延緩rds小鼠視網膜光感受器細胞的調亡。

    

    視網膜色素變性是一組常見的遺傳性致盲性視網膜疾病，至今臨床上未發現確切有效的治療方法。動物實驗報導，遺傳性RP的病理機制是光感受器細胞調亡，抗凋亡治療和某些鈣離子拮抗劑可延緩遺傳性RP小鼠光感受器細胞的調亡。葛根素是從中藥葛根中提取的異黃酮類有效成分，在臨床上廣泛用於心腦血管等疾病的治療。最近研究報導，葛根素具有鈣離子拮抗和抗調亡等多種藥理作用。本實驗似通過光鏡和電鏡觀察葛根素對遺傳性RP動物模型rds小鼠的治療作用，並通過TUNEL技術檢測調亡和免疫組化技術測定Bcl-2在視網膜光感受器細胞及其內外段的表達，探討葛素對rds小鼠的治療作用和干預機制。

 

    1 材料與方法

    1．1 動物rds小鼠和正常C3B小鼠購自美國動物實驗中心The Jackson Laboratory 600MainST.，Bar Harbor ,Me,美國），在中山大學動物實驗中心配種飼養，迴圈光照（光照12h， 黑暗12h）、25℃、無菌環境下飼養。

 

    1．2 動物分組：rds和C3B新生小鼠各84只隨機分為2組，每組42只小鼠，從小鼠出生當日（0d）到35d每天稱體質是，根據體重注射藥物。實驗組採用葛根素（浙江康恩貝制藥有限公司）ip給藥，80mg/kg（人用等效劑量的2倍），每天2次（9：00和17：00時）。對照組用等量生理鹽水ip給藥。分別在小鼠出生後0、3、7、14、21、28、35d處死小鼠，取眼球，立即經4%中****馬林PBS溶液固定過夜，作病理檢查（每個時間點取11只眼球）。另取1只眼球經2.5%中性戊二醛溶液(Ph7.2)固定，做電鏡觀察。

 

    1．3 光鏡觀察：4%中****馬林溶液固定24 h後，經角膜緣切開取出晶狀體，置於50%乙醇1 h，常規脫水包埋（包埋時眼球水準放置），切片厚度為3um，切片再經脫蠟、蘇木素染10min、伊紅複染5s和中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察和計數近赤道中央後視網膜光感受器細胞的層數或密度，並照相。

 

    1．4 電鏡觀察：2。5%中性戊二醛溶液固體12 h 以上，取水準眼球赤道扣視網膜組織1mmX3mm,0.01mol/L 磷酸緩衝液沖洗3次，逐級乙醇脫水，環氧樹脂包埋。切1um的半薄切片作光鏡定位，然後做超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。日立H-600型透射電鏡觀察視網膜超微結構。

 

     1．5 凋亡原位標記法（TUNEL）測定：玻片常規脫蠟，0.01 mol/LPBS 沖洗3次,每次3 min,加3%過氧化氫20 UL,內源酶阻斷10min，0.01 mol/L PBS 沖洗3次，每次3 min，加10ug/Ml 蛋白酶K（德國Merck公司）20UL，室溫消化20 min，0101 mol/L PBS沖洗3次，每次3 min，加原位雜交試劑盒（購自Roche）的1液與2液混合液（1：10，新鮮配製）10UL，室溫60 min，0.01 mol/L PBS 沖洗3次，每次3 min。1液含未端去氧核苷核酸轉移酶，2液含核苷酸混合液和螢光素標記的dUTP。同時取2液20UL，做兩張陰性對照片。加3液（含有辣根過氧化物酶標記的抗螢光素抗體，該抗體取自羊抗的Fab段）10uL，室溫30 min，0.01 mol/L PBS 沖洗3次，再用0101 mol/L PBS沖洗1次。加DAB顯色液（武漢博士德）（1mL蒸溜水中加A、B、C3種液體各30UL，新鮮配製），顯色15 min。自來水沖洗，蘇木素複染3 min，自來水沖洗、涼幹，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察，計數視網膜不感受器細胞核陽性染色的數目，每個樣本在油鏡下計數100個細胞，觀察2張玻片，取均數，計算凋亡率，即調亡細胞占細胞總數的百分率。同時做陽性對照（視網膜母細胞瘤）和陰性對照（只加2液）片各兩張。

 

      1．6 免疫組化方法測定bcl-2表達：玻片常規脫蠟，0.01 mol/L PBS 沖洗3次，每次3 min，加3%過氧化氫20uL，內源酶阻斷10min，0.PBS沖洗3次，每次3min；加兔抗小鼠Bcl-2（Santa Cruz）的1抗20μl,室溫5h，0.01mol/L PBS沖洗1次。加DAB顯色液（1ml蒸餾水種加A、B、C3種液體各30ml，新鮮配製），顯色15min。自來水沖洗，蘇木素複染3min，自來水沖洗、涼幹，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察視網膜各層的染色情況，標準為：末染色計“-”，計數轉換為0，淺黃色計“+”，計數轉換為1，黃色計“++”，計數轉換為2，棕色計“+++”，計數轉換為3。同時做不加1抗和不加2抗的陰性對照片各兩張。1.7統計運算：採用SPSS統計軟體，調亡率用t檢驗陽性表達數位轉化後採用t檢驗。

 

      2  結果

     2．1葛根素對rds小鼠視網膜外核層細胞層數的影響：rds小鼠視網膜經HE染色顯示，葛根素藥物治療組與照組相比較，在7d視網膜外核層的厚度變化無差異，在14、21、28、35d時，外核層的厚度明顯增加（P<0.05、0.01）.結果表明,葛根素藥物治療對rds小鼠視網膜感受器細胞層數的減少有明顯的延緩，結果表明葛根素藥物冶療可延緩rds小鼠視網膜外核層細胞層數的頭減少。正常C3B小鼠光感受器細胞在7-35d，實驗組與對照組無明顯差異，其結果7d為9-10層，14-35d分別是11-12層。

 

     2．2 葛根素藥物治療對rds小鼠視網膜光感受器細胞及其外段超微結構變化的影響：由表2和圖2可見，經用葛根素藥物治療後與未用藥的對照組比較，第14天，外段盤膜部位的線粒體豐富、較厚，外界膜較連續；第21天盤膜基本形成，第21、28、35天盤膜較厚、溶解較少，外界膜較連續，外核層細胞凋亡較輕。結果表時，葛根素可明顯減弱rds小鼠視網膜外核層細胞的病變程度，並對外段盤膜部位的線粒體、盤膜和外界膜的破壞起明顯的延緩作用。

    表1葛根素對rds小鼠視網膜光感受器細胞層數的影響(x ± s,n=11)

 

 

 

 

 

 

 

 

                      表2葛根素治療後rds小鼠視網膜光感受器細胞及其外段超微結構的變化

 

           表3 葛根素對rds小鼠視網膜光感受器細胞的抗凋亡作用（x ± s, n=11）

 

      2.3葛根素對rds小鼠視網膜光感受器細胞的抗凋亡作用：由上表3可知，經用葛根素治療后，rds小鼠視網膜光感受器細胞的凋亡率在3、7、14、21、28、35天與對照組相比較，明顯下降。結果表明，葛根素可明顯抑制rds小鼠視網膜外核層細胞的凋亡。

 

      2.4葛根素對rds小鼠視網膜光感受器細胞及其外段Bcl-2表達的影響：由表4可知，Bcl-2主要在rds小鼠視網膜光感受器細胞間質和光感受器內外段表達。經用葛根素治療后7、14、21、28、35天，rds小鼠視網膜光感受器細胞及其內外段Bcl-2的表達與對照組相比羅明顯升高。結果表明，葛根素可提高rds小鼠視網膜光感受器細胞及其內外段Bcl-2的表達。

 

      表4 葛根素對rds小鼠視網膜光感受器細胞及其內外段Bcl-2表達的影響(x ± s,n=11)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      3.討論

     rds 小鼠是由peripherin/RDS基因的純合突變引起的視網膜變性動物模型.該基因的突變導致的視網膜變性慢蛋白產生受限,影響了外節盤膜的形成﹑更新和穩定,最終導致光感受器細胞凋亡.在人類,該基因的突變導致常染色體顯性視網膜包素變性﹑遺傳性黃斑變性等多種網膜病變.

 

    實驗研究表明,RP的病理機制是視網膜光感受器細胞凋亡,自由基﹑超氧离子和興奮性神經遞質谷氨酸的產生增多或畜積可導致視網膜神經細胞的凋亡[6].

 

     雖然對RP的治療目前臨床上未發現有效的治療藥物和治療方法,但實驗研究發現某些鈣离子阻斷劑﹑神經營養因子﹑抗凋亡治療和基因治療等具有延緩遺傳性動物模型光感受器細胞的凋亡作用.Takano等[3]應用鈣离子阻斷劑尼伐地平﹑尼卡地平﹑硝苯地平﹑硫氮卓酮對rd鼠時進行實驗治療作了比較研究,結果顯示,尼伐地平作用最強,尼卡地平次之,而硝苯地平和硫氮卓酮對rd小鼠無治療作用.Liang等報道黑激素(melatonin)具有延緩rds小鼠視網膜光感細胞凋亡的作用.Cayouette等將色素上皮細胞來源的因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)注入rd和rds小鼠眼內,可延遲rd小鼠光感受器細胞的損失和减少rds小鼠光感受器細胞凋亡的數目.

    

Bcl-2是重要的抗凋亡因子,可存在於綫粒體外膜﹑核膜和內質網膜上,對保持膜的完整性起重要作用.研究報道視網膜光感受器Bcl-2過表達,可抑制細胞凋亡.Eversole-Cire等將Bcl-2和BAG-1的表達基因聯合轉移到視紫紅質S334Ter突變轉基因動物模型中,結果表明,Bcl-2和BAG-1兩者共同在視網膜光感受器細胞層過表達可延遲光感受器細胞凋亡達7～9週.

 

    目前關於葛根素的研究報道較多,牠的主要作用機制是抑制腺苷環化酶﹑阻滯β受體,提高超氧化物岐化酶活性﹑增強抗氧化能力,使P450活性增強,抗谷氨酸引起的神經毒性,改善眼局部微循環,鈣離子通道阻滯,抗細胞凋亡等[4,5]作用.應用高效液相技術也测定出葛根素通過ip給藥可以透過血眼屏進入眼內,爲葛根素發揮治療作用提供了依据.

 

     本研究結果表明,葛根素對rds小鼠治療後7﹑14﹑21﹑28﹑35 d,視網膜外核層細胞的凋亡明顯較少,同時上調視網膜光感受器細胞間質及其外段Bcl-2的表達.葛根素對rds小鼠可能的作用機制是:①提高超氧化物岐化酶活性﹑增强抗氧化能力.②抗谷氨酸引起的神經毒性,改善眼局部微循環.③鈣離子通道阻滯,抑制鈣離子內流,减少鈣離子在細胞內蓄積.④直接增加視網膜Bcl-2的表達,抑制rds小鼠光感受器細胞的凋亡.葛根素在rds小鼠中抗光感受器細胞凋亡的其他作用機制及有關的信號傳導等重要問題亦有待深入探討.

 

參考文獻:

[1]鄧新國,胡世興,賈小芸,等.川芎嗪對rd和rds小鼠視網膜光感受器細胞乾預作用的光鏡觀察[J].中草藥,2006,37(6):891-894.

[2]Kalloniatis M, Fletcher E L. Retinitis Pigmentosa:understanding the clinical presentation,mechanisms and treatment options [J]. Clin exp optom,2004,87(2):65-80.

[3]Takano Y, Ohguro H, Dezawa M,et al. Study of drug effects of calcium channel blockers on retinal degeneration of rd mouse [J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,313(4):1015-1022.

[4]肖桂鳳,寧**民,葛亞坤,等.葛根素對培養人臍靜脈內皮細胞鈣超載的影響[J].中國藥理學報,2005,21(11):1388-1392.

[5]張斌,魏欣冰,劉慧青,等.羥乙基葛根素對腦星形膠質細胞氧化性損傷的保護作用[J].藥學學報,2006,41(2):171-174.

[6]Delyfer M N, Leveillard T, Mohand-Said S,et al. Inherited retinal degeneration:Therapeutic prospects [J]. Biol Cell,2004,96(4):261-269.